如今，流式細胞分析在實驗室中是越來越常見。然而，設計一個多色的分析卻讓人很頭疼。在此，Bio-Rad的流式專家教你10個技巧，能幫助你設計出一個成功的多色流式分析實驗。

1. 熟悉你的流式細胞儀

了解你所用的流式細胞儀的性能，這非常重要。大多數流式細胞儀有兩個或多個激光器，有五種波長可供選擇：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、藍色（488 nm）、黃色（561 nm）和紅色（640 nm）。除了激光器，具體的濾光片和檢測器也決定了你的配置。這些明確了可同時檢測多少種顏色（新的儀器可能超過17種）。熒光微球的定期清洗和校準將讓你更好地利用流式細胞儀。

2. 恰當地制備你的樣品

制備方法不當或不健康的細胞可能導致結果不佳，因為細胞死亡或結塊。在制備細胞時，你應當溫柔地對待它們，避免劇烈的渦旋振蕩。在染色時，如果實驗允許，細胞應放在冰上。細胞團塊會阻塞流式細胞儀，為了減少團塊的形成，應避免高的細胞密度。加入DNase I或EDTA，也是個好辦法。

3. 去除死細胞

死細胞可能帶來假陽性的結果，因為自發熒光以及非特異的抗體結合增加。通過前向散射（FSC）和側向散射（SSC）設門不一定能排除死細胞，因此是使用活細胞/死細胞的染料。人們通常用碘化丙啶（PI）或7-AAD來鑒定死細胞，但這不適用于固定細胞。現在Bio-Rad還提供一種VivaFix™活細胞/死細胞染料，適用于活細胞或固定細胞。

4. 優化你的染色操作

抗體的非特異結合可能導致假陽性。通過添加BSA來封閉這些相互作用，可以減少這種非特異的結合。此外，許多細胞（如B細胞、NK細胞和巨噬細胞）在細胞表面有Fcg受體，可與抗體的Fc區域結合，造成非特異的染色。這些可通過添加FcR封閉試劑或使用F(ab)2片段來避免。高的抗體濃度也會增加非特異的結合。因此，抗體濃度應準確測定，以便提高信噪比。使用適當的抗體濃度是多色流式分析的關鍵。

5. 是否使用同型對照

你可能不想使用同型對照。但是，這樣做的前提是你有了其他適當的對照。同型對照與你的抗體有著相同的亞型、相同的熒光基團，來自相同的供應商，在相同濃度下使用。它的目的是確保觀察到的染色是由于特異性的抗體結合，從而排除Fcg受體的非特異結合，并排除抗體或熒光基團的非特異結合。