信帆生物專業做PCR實驗代測，實時熒光定量PCR實驗代測

南京信帆生物技術有限公司提供實驗室代測服務，包括酶免實驗代做，免疫組化，PCR，WB實驗代測等到，的設備加上技術嫻熟的實驗操作人員，讓您的每一份實驗結果均真實可靠，歡迎來dian咨詢！

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Real -Time PCR，即實時監測PCR擴增產物并進行解析的方法，它是在PCR反應體系中加入熒光物質，并通過Real -Time PCR檢測系統對PCR反應進程中的熒光信號強度進行實時監測，終對實驗數據進行分析處理的方法。Real -Time PCR自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來，廣泛應用于生物研究的各個領域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探針法兩種。

熒光定量PCR代測服實驗室試劑的操作：

1)所用的所有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

2)所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。

3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。

4)所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。

5)所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

6)新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。

7)樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。
 

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應注意的問題及其解決方法：

1．PCR反應條件的優化 
要優化特定的PCR反應，有必要試用不同的反應組分和循環參數。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對反應結果的影響，從中大家可以得到一些線索以改進反應條件，提高PCR產量和/或特異性，一般情況下，只須改變一兩個參數就行了，如pH值和MgCl₂濃度。表2-2給出了循環參數對PCR結果的影響。 

2．引物的設計 
毫無疑問，引物的堿基組成，長度及其靶序列的同源性是決定PCR成敗的首要因素，選擇設計引物在一定程度上仍然要靠經驗，對于某一對引物而言尚無通用的規則可嚴

3．出現異常結果時的解決思路 
在做PCR反應的過程中，由于其酶促反應的本質，影響終結果的因素較多，所以出現一些非預料的結果是可以理解的。下面簡單地總結一下在PCR反應結果出現異常時我們應該采取的措施。 

（1）電泳檢查沒有 PCR產物 

a．需檢查一下Taq DNA聚合酶是否失活，或是活性太低，還需查一下在加樣過程中是否向體系中加過Taq DNA聚合酶； 

b．需檢查一下所使用的引物，看其序列設計是否正確，是否堿基組成不平衡； 

c．需要檢查一下PCR反應過程中模板是否變性充分，尤其在前幾個循環中是否變性充分；可以適當地提高模板變性的溫度或是適當延長變性的時間；  

d．需檢查一下在PCR反應體系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制劑，如SDS污染等等； 

e．需檢查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染，可以預先加熱使之失活。 

熒光定量PCR代測服主要儀器及耗材：

旋渦振蕩器 ：上海青浦瀘西儀器廠產品
手握式電動勻漿機：德國FLUKO 公司產品
低溫冷凍離心機：Sigma（3K15）公司產品
Real-time檢測儀：ABI （ABI-7300）公司產品
超純水分離系統：美國LABCONCO公司
離心管及10μL、200μL、1000μL槍頭等常規耗材均為國產；RNA提取過程中所需的離心管、槍頭等耗材經過0.1%的DEPC水浸泡過夜，121℃滅菌30min，烘干后備用。
 

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