NI-NTA瓊脂糖凝膠6FF緩沖液制備

更新時(shí)間：2021-10-20

瀏覽次數(shù)：842

NI-NTA瓊脂糖凝膠6FF緩沖液制備

金屬螯合親和層析介質(zhì)，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過(guò)渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，F(xiàn)e3+發(fā)生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。因此，偶聯(lián)這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個(gè)組氨酸的蛋白以及對(duì)金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。一般來(lái)說(shuō)，Ni2+是用于純化組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)的優(yōu)選金屬離子。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結(jié)合，但這種結(jié)合力要遠(yuǎn)小于組氨酸殘基與金屬離子的結(jié)合力。鎳親和層析介質(zhì)具有特異性好、流速快的優(yōu)點(diǎn)，非常適合放大生物試劑。

Ni NTA瓊脂糖凝膠6FF預(yù)先偶聯(lián)Ni2+離子。通常，Ni2+是用于純化重組組氨酸標(biāo)簽蛋白的優(yōu)選金屬離子，用咪唑進(jìn)行洗脫。我們建議在含0.5-1.0 M NaCl的緩沖液，中性至弱堿性pH 7-8，這樣的條件下結(jié)合，經(jīng)常使用磷酸鈉緩沖液。也可以使用Tris-HCl，但是在金屬-蛋白質(zhì)親和力非常弱的情況下應(yīng)該避免，因?yàn)樗梢越档徒Y(jié)合強(qiáng)度，在緩沖液中避免螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽的存在。如果重組組氨酸標(biāo)簽蛋白表達(dá)為包涵體，則在所有緩沖液中包括高達(dá)6M Gua-HCl或8M尿素。當(dāng)使用

高濃度的尿素或Gua-HCl時(shí)，通常發(fā)生蛋白質(zhì)解折疊。包涵體變性復(fù)性是個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，一般的建議純化可溶蛋白。

提示：含有尿素的樣品可以通過(guò)SDS-PAGE直接分析，而含有Gua-HCl的樣品在SDS-PAGE之必須用尿素緩沖液置換緩沖液。

緩沖液制備

用于緩沖液制備的水和化學(xué)品應(yīng)具有高純度。使用通過(guò)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾緩沖液。使用高純度咪唑，因?yàn)檫@將在280nm處產(chǎn)生非常低的吸光度或沒(méi)有吸光度。

推薦緩沖液

結(jié)合緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，pH 7.4（佳咪唑濃度是依蛋白質(zhì)性質(zhì)而定的，20-40mM適用于許多蛋白質(zhì)）。洗脫緩沖液：20mM 磷酸鈉，0.5M NaCl，500mM 咪唑，pH 7.4（洗脫所需的咪唑濃度是依蛋白質(zhì)性質(zhì)而定的）。

注意事項(xiàng)：

1.上樣之，樣品必須經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾及去除色素，否則雜質(zhì)及色素會(huì)被吸附到填料上，影響填料的正常使用。

2.在使用過(guò)程中，避免使用高濃度的強(qiáng)酸強(qiáng)堿，酸和堿的濃度應(yīng)低于 0.1 摩爾。堿會(huì)使流速變慢。

3.不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行。