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高效液相色譜法（HPLC）

以高壓液體為流動(dòng)相的液相色譜分析法稱高效液相色譜法（HPLC）。其基本方法是用高壓泵將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入裝有填充劑的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入的樣品被流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色信號(hào)或進(jìn)行數(shù)據(jù)處理而得到分析結(jié)果。

高效液相色譜儀(HPLC)用液體為流動(dòng)相的色譜分離分析方法。它在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測(cè)器等新實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。高效液相色譜儀(HPLC)適于溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對(duì)分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)。用途廣泛，占有機(jī)物的80%。

（HPLC）優(yōu)點(diǎn)：

1、高壓：液相色譜以液體作為流動(dòng)相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。在現(xiàn)代液體色譜中供液壓力和進(jìn)樣壓力都很高，一般可達(dá)到15～30MPa，甚至可達(dá)MPa

2、高速：高效液相色譜的流速較之經(jīng)典液體色譜快得多，一般可達(dá)l—10mL／min， 個(gè)別可高達(dá)100mL／min以上，這已近似于氣相色譜的流速。 高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h 。

3、高效：氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高，一般約可達(dá) 60000理論塔板／米；近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。

4、高靈敏度：紫外檢測(cè)器的小檢測(cè)量可達(dá)毫微克數(shù)量級(jí)(10-9 g)；熒光檢測(cè)器的靈敏度可達(dá)10-11g。高效液相色譜的高靈敏度還表現(xiàn)在所需試樣很少；微升數(shù)量級(jí)的樣品就足以進(jìn)行全分析。

熒光實(shí)時(shí)定量QPCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，終通過相對(duì)定量或絕對(duì)定量的方法確定各個(gè)樣本的本底表達(dá)量。qPCR所使用的熒光化學(xué)試劑可分為兩種：熒光染料和熒光探針。

熒光染料SYBR Green：嵌入到雙鏈DNA分子后構(gòu)象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步

擴(kuò)增曲線和溶解曲線的常見術(shù)語：

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