目前分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP、RAPD、ISSR、 AFLP、 SSR、SCAR和單核苷酸多態(tài)性 (SNP)、表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST)等。由于PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，基于PCR的標(biāo)記體系類型多樣，應(yīng)用廣泛，但各自的復(fù)雜性、可靠性與遺傳信息不同。如RAPD方法簡單、成本低，但重復(fù)性較差、檢測(cè)位點(diǎn)不多；SSR多為共顯性、重復(fù)性好，但位點(diǎn)較少、引物開發(fā)成本高；AFLP譜帶多，但分析程序復(fù)雜、成本高，有時(shí)要用到同位素，而且甲基化敏感的限制酶由于基因組DNA的甲基化可導(dǎo)致“假多態(tài)性”產(chǎn)生，識(shí)別AATT位點(diǎn)的MseI酶常會(huì)引起一些物種基因組中標(biāo)記分布不均衡；多數(shù)情況下，RAPD與AFLP標(biāo)記測(cè)序需要克隆，增加了工作量。

   引物設(shè)計(jì)是SRAP分析的核心。SRAP標(biāo)記分析共有兩套引物。在一組正向SRAP引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特異結(jié)合可譯框（ORFs）區(qū)域中的外顯子。研究表明外顯子一般處于富含GC區(qū)域，如擬南芥2和4號(hào)染色體的全序列中，外顯子CG比例分別為46.5%和44.08%，而內(nèi)含子中則為 32.1%和33.08 %；而且除著絲粒區(qū)域有較低基因密度外，基因幾乎平均分布在這兩個(gè)染色體上。從GenBank中隨機(jī)選擇20個(gè)BAC序列，發(fā)現(xiàn)約66%的CCGG序列位于這些克隆中的外顯子內(nèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，擬南芥約1/3基因組外顯子位于2、4號(hào)染色體上。運(yùn)用CCGG序列就可特異擴(kuò)增出包含這些組分的序列。 
   當(dāng)然，由于外顯子序列在不同個(gè)體中通常是保守的，這種低水平多態(tài)性限制了將它們做為標(biāo)記的來源。由于內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列在不同物種甚至不同個(gè)體間變異很大，富含AT的區(qū)域序列通常見于啟動(dòng)子和內(nèi)含子中，SRAP中使用的反向引物的3′ 端含有核心AATT，以特異結(jié)合富含AT區(qū)，這就使得有可能擴(kuò)增出基于內(nèi)含子與外顯子的SRAP多態(tài)性標(biāo)記。 

   引物大小和引物組合是成功進(jìn)行SRAP分析的關(guān)鍵。SRAP-PCR反應(yīng)體系中使用兩個(gè)引物：17堿基正向引物（F-primer）和18堿基反向引物(R-primer)；早期反向引物在3’端選擇性核苷前多一個(gè)C（19個(gè)）；使用同位素檢測(cè)時(shí)引物可用33P-ATP標(biāo)記。正向引物含有一段14堿基的核心序列（core sequence）：5′端*個(gè)堿基為“填充”序列（filler sequence），無任何特異組成，接著為CCGG序列；隨后為3′ 端的3個(gè)選擇性堿基，選擇性堿基的變化與相同核心序列組合成一套正向引物。反向引物的組成與正向引物類似，但“填充”序列后連接的為AATT；AATT序列后為3個(gè)選擇性可變堿基，位于引物3′ 端。當(dāng)然，構(gòu)建正向與反向引物的總體要求是它們不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)及其他二級(jí)結(jié)構(gòu)，且CG含量為40%－50%，且兩者“填充”序列在組成上必須不同，長度為10或11個(gè)堿基。 

   目前文獻(xiàn)中報(bào)道的部分標(biāo)準(zhǔn)引物序列如下： 
   正向引物Forward primer 反向引物Reverse primer
   me1:5′TGAGTCCAAACCGGATA-3′ em1:5′GACTGCGTACGAATTAAT-3′
   me2:5′TGAGTCCAAACCGGAGC-3′ em2: 5′GACTGCGTACGAATTTGC-3′ 
   me3:5′TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ em3: 5′GACTGCGTACGAATTGAC-3′
   me4:5′TGAGTCCAAACCGGACC-3′ em4: 5′GACTGCGTACGAATTTGA-3′
   me5:5′TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ em5: 5′GACTGCGTACGAATTAAC-3′ 
   me6:5′TGAGTCCAAACCGGTAA-3′ em6: 5′GACTGCGTACGAATTGCA-3′ 
   me7:5′TGAGTCCAAACCGGTCC-3′ em7: 5′GACTGCGTACGAATTCAA-3′
   me8:5′TGAGTCCAAACCGGTGC-3′ em8: 5′GACTGCGTACGAATTCTG-3′
   em9: 5′GACTGCGTACGAATTCGA-3′ 
   em10: 5′GACTGCGTACGAATTCAG-3′
   em11: 5′GACTGCGTACGAATTCCA-3′

   實(shí)驗(yàn)表明，用單引物擴(kuò)增只能擴(kuò)增幾條大約0.5~1kb的片段；使用較短引物，10堿基RAPD引物，以及含有SRAP引物核心序列的14－15堿基大小的引物，這些引物組合可得到多種擴(kuò)增片段，但是擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定，特異性不強(qiáng)；20-22堿基引物放射自顯影的結(jié)果背景太強(qiáng)；合適的引物大小在17－18堿基。 

   反應(yīng)模板多數(shù)是基因組DNA，也可以是cDNA。在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，0.2mmol/L dNTPs,1.5mmol/L Mgcl2,0.3µmol/L引物，1U Taq酶。SRAP-PCR反應(yīng)采用復(fù)性變溫法：開始94℃變性5min；反應(yīng)前5個(gè)循環(huán)在94℃ 1min，35℃ 1 min，72℃ 1－2 min條件下運(yùn)行；之后30－35個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度提高到50℃，zui后延伸5~7 min。 
   前5個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度設(shè)為35℃ ，主要是考慮到低的復(fù)性溫度能確保兩個(gè)引物與靶DNA部分配對(duì)；隨后循環(huán)中復(fù)性溫度升到50℃，可保證前5個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物可在余下循環(huán)中進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增；如果復(fù)性溫度在40個(gè)循環(huán)中都保持在35℃，擴(kuò)增片段重復(fù)性將很低。


   擴(kuò)增產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離，通常膠板35 cm×43cm，厚度0.8mm，每孔加樣 8－20 微升，以保證單條帶足夠量回收。可使用同位素，也可采用銀染技術(shù)；用2.0%的瓊脂糖凝膠也可分析多態(tài)性，但分辨的條帶較少。
   對(duì)標(biāo)記測(cè)序有可能獲得更多的遺傳信息。由于多數(shù)SRAP產(chǎn)生高強(qiáng)帶，很少有重疊，而且引物較長，故比AFLP易測(cè)序。獲得的SRAP標(biāo)記差異片段，從膠上割下、回收后，用相應(yīng)引物直接測(cè)序，必要時(shí)可采用克隆測(cè)序。


   由于在設(shè)計(jì)引物時(shí)正反引物分別是針對(duì)序列相對(duì)保守的編碼區(qū)與變異大的內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列，因此，多數(shù)SRAP標(biāo)記在基因組中分布是均勻的，通過利用RIL系構(gòu)建的遺傳連鎖圖也說明了這一點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在130個(gè)SRAP標(biāo)記中，約20%為共顯性，這種高頻率的共顯性則明顯優(yōu)于AFLP標(biāo)記。
   利用同一引物組合，從甘藍(lán)類不同作物中（包括花椰菜、青花菜等）可獲得多個(gè)SRAP標(biāo)記。單個(gè)組合在每個(gè)個(gè)體中可檢測(cè)到至少10條多態(tài)性譜帶，其中一些為作物特異的；在不同的實(shí)驗(yàn)中多態(tài)性條帶重復(fù)性*。 SRAP標(biāo)記測(cè)序顯示多數(shù)標(biāo)記為外顯子區(qū)域。25條多態(tài)性帶中16條（64%）序列GC含量超過35%，表明可能是外顯子部分；Blast搜索表明60%條帶與已知基因序列高度一致，這就確認(rèn)了SRAP產(chǎn)生的多數(shù)標(biāo)記包含了可譯框中的外顯子。測(cè)序還表明SRAP多態(tài)性產(chǎn)生于兩個(gè)方面：由于小的插入與缺失導(dǎo)致片段大小改變，而產(chǎn)生共顯性標(biāo)記；核苷酸改變影響引物的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致顯性標(biāo)記產(chǎn)生。

   靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性 (target region amplified polymorphism，TRAP)也是一種新型的基于PCR標(biāo)記，由美國農(nóng)部北方作物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室Hu與Vick于2003年提出。與SRAP、RAPD和AFLP等標(biāo)記技術(shù)無須任何序列信息即可直接PCR擴(kuò)增不同，TRAP技術(shù)是基于已知的cDNA 或EST序列信息。目前已獲得許多物種基因組序列的豐富信息，包括人類、擬南芥，以及重要作物水稻和多種微生物的基因組序列草圖繪制成功，有大量的EST序列可供使用，從而使得可以利用生物信息學(xué)工具和EST數(shù)據(jù)庫信息產(chǎn)生出許多靶基因序列的TRAP多態(tài)性標(biāo)記，而且極易將性狀與標(biāo)記相關(guān)聯(lián)。
   TRAP技術(shù)是從SRAP技術(shù)改進(jìn)而來的。SRAP使用兩個(gè)任意引物；而TRAP是使用長度為16~20核苷的固定引物（fixed primer）與任意引物(arbitrary prime)，固定引物以公用數(shù)據(jù)庫中的靶EST序列設(shè)計(jì)而來；任意引物與SRAP所用的一樣，為一段以富含AT或GC為核心、可與內(nèi)含子或外顯子區(qū)配對(duì)的隨機(jī)序列。固定引物的設(shè)計(jì)步驟為：從EST數(shù)據(jù)庫中鑒別所需序列，再采用有關(guān)引物設(shè)計(jì)軟件（如Primer3等） 設(shè)定核苷酸序列合理長度（18堿基）與zui適、zui大和zui小Tm值（53、55、50℃），zui后選定zui適的引物; 任意引物設(shè)計(jì)*同SRAP技術(shù)。TRAP-PCR反應(yīng)條件與SRAP-PCR*一致。每次TRAP-PCR反應(yīng)在6.5%聚丙烯酰胺測(cè)序膠可產(chǎn)生50－900bp的片段30-50 個(gè)。 


   SRAP分子標(biāo)記系統(tǒng)zui早是在蕓薹屬作物開發(fā)出來。目前已在其他作物如馬鈴薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、蘋果、櫻桃、柑橘與芹菜中也成功擴(kuò)增。TRAP技術(shù)是在向日葵中開發(fā)的，目前已成功應(yīng)用于其他作物如水稻、菜豆、大麥、小麥、甜菜。主要用于種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀基因標(biāo)記、gDNA與cDNA指紋分析乃至圖位克隆等方面。


   由于在不同物種、不同個(gè)體間具有一定的多態(tài)性，SRAP技術(shù)也成功應(yīng)用于種質(zhì)鑒定與評(píng)價(jià)工作中。Ferriol等（2003）對(duì)甜瓜（Cucurbita pepo）的2個(gè)變種69份類型代表性材料遺傳多樣性進(jìn)行了SRAP、AFLP標(biāo)記與形態(tài)學(xué)分析，結(jié)果表明，與形態(tài)學(xué)變異及類型的進(jìn)化歷史一致性方面，SRAP標(biāo)記提供的信息比AFLP標(biāo)記更優(yōu)良；11個(gè)SRAP引物組合獲得88條可重復(fù)的條帶，平均8條，其中64條（72.7%）為多態(tài)，大小在154-653bp 之間；測(cè)序發(fā)現(xiàn)多個(gè)標(biāo)記序列與已知cDNA或EST高度同源。另外還利用SRAP標(biāo)記對(duì)筍瓜（C.maxima）19 份種質(zhì)及8份南瓜屬材料遺傳多樣性進(jìn)行分析，24個(gè)引物組合產(chǎn)生的114個(gè)標(biāo)記中多態(tài)性占33%，雖然低于RAPD比例，但聚類分析與主坐標(biāo)分析表明，SRAP標(biāo)記分析可將材料按照使用類型（食用、飼用、觀賞用）來分組。因此，在對(duì)育種目標(biāo)性狀的評(píng)價(jià)方面，明顯優(yōu)于RAPD標(biāo)記。
   野牛草（Buffalograss）生長緩慢、耐旱、耐瘠、抗蟲，倍性多樣，遺傳基礎(chǔ)廣泛。Budak等利用SRAP標(biāo)記分析了buffalograss的43個(gè)基因型遺傳多樣性，結(jié)果也表明SRAP是一個(gè)評(píng)價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生的有效工具。 
   向日葵屬野生種在栽培品種遺傳改良方面很有價(jià)值，對(duì)于重要病害，尤其是霜霉病是很好的抗源，但大部分野生種是多年生，從野生種中鑒定基因非常困難。Hu等設(shè)計(jì)了與向日葵EST數(shù)據(jù)庫中編碼富含亮氨酸重復(fù)（LRR）類似蛋白序列配對(duì)的固定引物，利用TRAP標(biāo)記分析，對(duì)向日葵屬16個(gè)野生種及其2個(gè)雜交種的遺傳變異性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明TRAP標(biāo)記可用于評(píng)估向日葵的遺傳多樣性，材料的聚類結(jié)果與經(jīng)典分類相一致；其中一個(gè)TRAP引物結(jié)合到與抗病性有關(guān)的基因序列。表明TRAP技術(shù)將在種質(zhì)基因型鑒別和重要目的農(nóng)藝性狀的基因標(biāo)記方面存在廣泛的應(yīng)用前景。 

   利用collard × cauliflower形成的RIL86個(gè)群體，構(gòu)建了由130個(gè)SRAP、120個(gè)AFLP標(biāo)記組成的遺傳圖譜。類似AFLP標(biāo)記，SRAP均勻分布平衡在9個(gè)重要連鎖群上。高頻率共顯性與在基因組中均勻分布的特性將使其優(yōu)于AFLP標(biāo)記而成為一個(gè)構(gòu)建遺傳圖譜的良好標(biāo)記體系。 


   轉(zhuǎn)錄圖譜（transcriptome map）是進(jìn)行比較基因組學(xué)研究極為有效手段。利用基于PCR的cDNA-SRAP分析來檢測(cè)編碼區(qū)的多態(tài)性將簡便、、快捷。利用花椰菜DH植株與青花菜雜交產(chǎn)生的F2群體88個(gè)單株，使用48引物組合，從88個(gè)cDNA中檢測(cè)到281個(gè)多態(tài)性cDNA -SRAP標(biāo)記，平均每個(gè)引物對(duì)產(chǎn)生6個(gè)，21.1%為共顯性；構(gòu)建了由247個(gè)標(biāo)記組成的轉(zhuǎn)錄圖譜。利用這個(gè)圖譜，成功進(jìn)行了甘藍(lán)類蔬菜作物與擬南芥基因組的基因排列與組成分析，發(fā)現(xiàn)這兩類基因組的廣泛同一性，在190個(gè)多態(tài)性cDNA-SRAP標(biāo)記中，共有169個(gè)相似序列；這種同一性集中在某些染色體片段而非整個(gè)染色體上；甘藍(lán)中大多數(shù)重復(fù)區(qū)段集中對(duì)應(yīng)于擬南芥1號(hào)與5號(hào)染色體，而不是2號(hào)與4號(hào)染色體。 


   重要農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖標(biāo)記的獲得，將可進(jìn)行性狀分子標(biāo)記輔助選擇，提高育種的選擇效率與預(yù)見性，加快新品種的選育進(jìn)程。常用的標(biāo)記作圖群體有F2、BC1、DH、RIL等，標(biāo)記策略有BSA、NIL以及GRA等。BoGLS-ALK基因是十字花科中調(diào)節(jié)脂肪族芥子油糖苷脫飽和基因。利用RIL群體，采用SRAP技術(shù)，將該基因定位到連鎖群L1，距顯性標(biāo)記SRAP133 1.4cM。
   Li等于2003年在大白菜中也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與雄性不育基因有關(guān)的SRAP標(biāo)記，在油菜中篩選到一個(gè)與Rf連鎖的SRAP標(biāo)記，在芹菜中獲得一個(gè)與病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標(biāo)記。